2.1.2 Этапы синтеза инсулина.
Первичная структура молекулы инсулина была расшифрована Ф. Стэнглером в 1954 году. Инсулин стал первым белком с известной аминокислотной последовательностью. Инсулин – низкомолекулярный полипептид (м.в.в. = 5800 kd), состоящий из двух цепей с разным количеством аминокислотных остатков (цепь α - 21 и цепь β - 30). Полипептидные цепи соединены между собой двумя дисульфидными связями.
Различные виды инсулина отличаются не только аминокислотным составом, но и α-спиралью, которая обусловливает вторичную структуру гормона. Более сложной является третичная структура, которая образует участки, ответственные за биологическую активность и антигенные свойства гормона. Внутреннее строение молекулы инсулина важно для взаимодействия с его рецептором и проявления биологического действия. Исследованиями с помощью рентгеновских лучей установлено, что гексамерная единица кристаллического цинк-инсулина состоит из трех димеров. Димеры инсулина связаны в кристаллы водородными мостиками между В24 и В26 пептидных групп.
Ген инсулина был выделен и изучен одним из первых. Он расположен на коротком плече 11 хромосомы. Генная сеть, регулирующая продукцию инсулина в ответ на стимуляцию глюкозой, включает следующие процессы: 1) транспорт глюкозы в клетку; 2) метаболизм глюкозы; 3) процессы секреции инсулина; 4) путь сигнальной трансдукции от рецептора инсулина. Она содержит 27 генов, 74 белка и 27 метаболитов. Продукция инсулина под действием глюкозы регулируется повышением транскрипции гена инсулина, повышением стабильности инсулиновой РНК и повышением трансляции инсулиновой и-РНК.
Образование островков в поджелудочной железе крысы происходит на 10-й день онтогенеза, а на 11-й день в них уже определяется инсулин, уровень которого остается сравнительно стабильным в период с 12-го по 14-й день беременности, а затем (14- 20-й день) количество инсулина резко увеличивается. На 11-й день развития выявляется также глюкагон, и его уровень в несколько десятков раз превышает уровень инсулина. Из мезенхимальной ткани был выделен фактор, который стимулирует ДНК, РНК и синтез белка в панкреатическом эпителии эмбриона и осуществляет контроль над пролиферацией и дифференцировкой панкреатического эпителия в ацинозную ткань и B-клетки.
Биосинтез инсулина в β -клетках происходит из высокомолекулярных предшественников. Долгое время считалось, что они метаболически нейтральны. Теперь, показано, что каждый из продуктов синтеза инсулина обладает самостоятельной биологической активностью.
Сначала в эндоплазмтическом ретикулуме В-клетки синтезируется препроинсулин, имеющий в своем составе 110 аминокислотных последовательностей. Он способствует трансформации стволовых аценоинсулярных клеток в В-клетки. После отщепления т.н. сигнального полипептида, состоящего их 24 аминокислот, превращается в проинсулин. На превращение препроинсулина в проинсулин потребуется около 10-15 минут. Сигнальный полипептид, называемый еще N - концевая последовательность, направляет регенерацию В-клеток.
Проинсулин, состоящий в свою очередь, из 86 аминокислотных остатков, в аппарате Гольджи преобразуется путем отщепления С-пептида, содержащего 31 аминокислоту. Этот процесс занимает около 20-40 минут и происходит в малых (ранних) секреторных гранулах, под влиянием превращающих энзимов и с обязательной затратой энергии. Отщепление С-пептида от проинсулина происходит с помощью кальций-зависимых эндопротеаз РС2 (отщепляет С-пептид от А-цепи) и РС3 (отщепляет С-пептид от В-цепи) После этого образуются кристаллы активного инсулина, имеющего в своем составе 51 аминокислотный остаток, на что уходит 2-4 часа. И, наконец, образуются секреторные гранулы, содержащие “зрелый” инсулин, С-пептид, проинсулин (1-2%), кальций, цинк и амилин. Этот процесс длится 1-2 дня.
Скорость метаболизма проинсулина значительно ниже, чем инсулина. Кроме того, проинсулин имеет низкую аффинность к инсулиновому рецептору (5%). Секреция проинсулина влияет на скорость размножения В-клеток.
Проинсулин может попадать в кровоток, минуя секреторные гранулы. Эта нерегулируемая секреция проинсулина в норме не превышает 3-5%, но при сахарном диабете 2 типа в крови натощак определяется до 50% проинсулина. Таким образом, незрелые гранулы, содержащие проинсулин, прорываются в интерстициальное пространство. Полагаем, что это связано с цитолизом инсулоцитов и попаданием содержимого цитоплазмы в кровь.
В ряде клинических исследований была предпринята попытка использовать проинсулин в качестве потенциально длительно действующего инсулина. Однако, эти исследования были прекращены, поскольку в группе лиц, получавших проинсулин, было выявлено незначительное повышение уровня сердечной смертности.
Значение С-пептида уникально в отношении предотвращения развития осложнений сахарного диабета. В последние годы показано, что применение С-пептида вместе с инсулином для лечения больных, страдающих инсулинозависимым диабетом, приводит к стабилизации сосудистых осложнений диабета и отдаляет появление новых проявлений ангиопатии. Так, малые дозы биосинтетического С-пептида при его инфузии улучшали микроциркуляцию в мышцах, улучшали функцию почек. И, наоборот, в отсутствие С-пептида даже при нормогликемии, поддерживаемой инсулинотерапией, развивались нефропатия и микроангиопатии, свойственные диабету.
В течение последних лет внимание диабетологов привлечено к работам, в которых отмечены изменения в морфологии бета-клеток, включая фиброз островков и накопление в них амилоида. Относительно недавно обнаружено, что амилоид состоит из специфического белка амилина, структуру которого составляют 37 аминокислот. Амилин влияет на подавление постпрандиальной секреции глюкагона и продукцию глюкозы печенью; регуляцию опорожнения желудка, секрецию кишечных гормонов, ограничение уровня прандиальной гликемии. В исследованиях in vitro показано, что амилин уменьшает захват глюкозы и подавляет секрецию инсулина изолированными бета-клетками. Выдвинута гипотеза, что в связи с первичным дефектом на уровне бета-клеток при ИНСД, характеризующимся нарушением превращения проинсулина в инсулин, амилин (участник этого процесса в норме) откладывается в бета-клетках и снижает в дальнейшем секрецию инсулина. [Аметов и др. 2005].
Готовый к использованию инсулин вместе проинсулином и интермедиатными формами I и II (около 6% ), С-пептидом (94%), и ионами цинка хранится в гранулах и выводится путем экзоцитоза под влиянием разных сигналов. Инсулин, С-пептид и проинсулин различаются биологической активностью и длительностью существования. Так, период полураспада инсулина составляет 3-10 мин, С- пептида – около 30 мин, проинсулина – около 20-23 мин. По мере созревания гранул уменьшается количество проинсулина и увеличивается количество инсулина, при взаимодействии которого с ионами цинка образуются кристаллы. Они локализуются в центре гранулы и обусловливают повышенную электронную плотность при морфологических исследованиях поджелудочной железы. С-пептид располагается по периферии гранулы. В-клетки поджелудочной железы у человека содержат более десяти тысяч секреторных гранул. Одна гранула содержит около 300 000 молекул инсулина.